平场校正的知识

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1. 什么是“平场图像”

  • 定义：在不放样品、仅用均匀的光源照亮感光器（CCD/CMOS）的情况下拍到的图像。
  • 特点：图像上只包含系统光路+传感器的不均匀性，不包含样品信号。
  • 作用：用来测量系统固有的亮度分布，以便后续做校正。

2. 在 PCR 系统中获取的方法

以做荧光 PCR 为例：

  1. 取下反应板或用空白板
    • 不要有荧光试剂的孔，避免信号差异
    • 最好用一个荧光均匀板（有些厂商叫 calibration plate），它的表面涂有均匀的荧光材料
    • 如果没有，可以放一张均匀漫反射片（白色 Teflon、积分球片等）并用光源直接照
  2. 光源设置为正常工作模式
    • 打开 PCR 系统的荧光激发光源（LED/激光），滤光片位置不变
    • 确保光源预热到稳定状态（有些 LED 刚亮时亮度会漂）
  3. 相机曝光设置固定
    • 曝光时间、增益、ISO 等全部固定成你实验时的参数
    • 不要用自动曝光
  4. 拍摄多帧（至少 6 张）
    • 文件名分别保存为 flat1.tif ~ flat6.tif
    • 多帧是为了后续平均，降低随机噪声（CCD 热噪声、量子噪声）
  5. 保存为 16-bit TIFF 灰度
    • 16 位可以保留更多动态范围，避免校正时精度损失

3. 为什么要多张而不是一张

  • 单帧可能有随机噪声和瞬时干扰（比如电源纹波、偶发热噪）
  • 多帧平均能得到非常平滑的亮度分布曲面，校正效果更稳定
  • 你的 PDF 里推荐的也是 6 帧取平均 再倒数校正

4. 如果你没有荧光均匀板

可以临时做一个简易版本：

  • 用一张厚白色塑料片（亚克力或聚四氟乙烯）放在光路中代替样品
  • 确保它能把光扩散均匀
  • 亮度尽量接近你平时实验中荧光信号的范围
  • 这种方式虽然不如标准板精确，但可以先完成算法调试

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